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OMBOE создатель Mind Map: OMBOE

1. Puce à ADN

1.1. Objectifs

1.1.1. Etudier le transcriptome (niveau d'expression d'un gène) selon le tissu, le type cellulaire, l'organisme...

1.1.2. Etudier le polymorphisme (mutations ponctuelles)

1.2. Etapes :

1.2.1. 1) ADN ou ADNc étudié est chargé sur la puce et s'hybride sur la sonde s'ils sont complémentaires (sondes présentes sur la puce)

1.2.2. 2) Emission de fluorescence (différentes couleurs pour différentes conditions)

1.2.3. 4) Analyse de la composition taxonomique, comparaison avec banques de données

1.2.3.1. 3) Normalisation des données

1.3. Analyse ciblée

1.3.1. 2 types : Oligochips et Microarrays

2. Hybridation in Situ

2.1. Objectifs :

2.1.1. Voir un gène cible dans un tissu ou organisme

2.1.2. Suivre l'expression d'un gène

2.2. Analyse ciblée

2.2.1. Besoin de connaître la séquence

2.3. Etapes

2.3.1. 1) Synthèse des sondes

2.3.1.1. ADN, ARN ou oligonucléotides complémentaires de la séquence cible

2.3.2. 2) Marquage des sondes

2.3.2.1. Marquage chaud : radioactif

2.3.2.2. Marquage froid : molécules fluorescentes, phosphorescentes....

2.3.2.2.1. Marquage direct : molécules fluorescentes

2.3.2.2.2. Marquage colorimétrique indirect "en sandwich"

2.3.3. 3) Hybridation des sondes

2.3.3.1. Dénaturation ADN de l'échantillon

2.3.3.2. Hybridation

2.3.4. 4) Détection du signal (grâce au marquage) par microscopie

2.4. Applications

2.4.1. Détection d'un pathogène dans un tissu

3. Southern blot

3.1. Objectifs

3.1.1. Détecter et quantifier un ADN cible dans un échantillon complexe

3.2. Etapes

3.2.1. 1) Extraction ADN de l'échantillon

3.2.2. 2) Séparation sur gel

3.2.3. 3) Transfert sur une membrane de nitrocellulose

3.2.3.1. une solution alcali passe à travers une éponge, plaquant l'ADN qui a migré sur la feuille de nitrocellulose

3.2.4. 4) Hybridation de sondes

3.2.4.1. on met la feuille avec l'électrophorèse dans un sac en plastique fermé contenant plein de sondes d'ADN marquées

3.2.5. 5) Révélation : l'épaisseur des bandes indique la quantité d'ADN cible

3.2.5.1. utilisation d'un gène de référence pour évaluer la quantité

3.3. Applications

3.3.1. Dans un échantillon, détecter la présence de certaines espèces

3.3.2. Analyse de l'eau : détecter la présence de bactéries pathogènes

3.4. Analyse ciblée

4. Extraction et purification de l'ADN

4.1. Objectifs

4.1.1. Séparer l'ADN des autres composants cellulaires

4.1.2. Purifier l'ADN sans coupures

4.1.3. Inactiver les DNases (nucléases)

4.2. Etapes :

4.2.1. 1) Lyse cellulaire

4.2.1.1. broyage mécanique

4.2.1.1.1. destruction des tissus pour accéder aux cellules et à l'ADN (mortier, mixeur)

4.2.1.2. tampon de lyse

4.2.1.2.1. détergents (SDS,Triton) : dispersent les bicouches lipidiques des membranes + agents de dénaturation des protéines (proteinase K)

4.2.2. 2) Elimination des protéines

4.2.2.1. solvants organiques

4.2.2.1.1. si phénol à pH 8 : protéines dans le culot, surnageant = ADN + ARN

4.2.2.1.2. si phénol à pH 5-6 : protéines dans le culot, couche d'ADN, surnageant ARN

4.2.2.2. centrifugation pour la séparation

4.2.3. 3) Précipitation de l'ADN

4.2.3.1. utilisation d'éthanol absolu

4.2.3.2. centrifugation

4.2.3.3. lavages à l'eau stérile

4.3. Méthodes d'analyse

4.3.1. Analyse par spectrophotométrie

4.3.1.1. Maximum d'absorption à 260 nm

4.3.1.1.1. Concentration A260nm = A260 x 50 µg/mL

4.3.1.2. Pureté de l'ADN (protéines)

4.3.1.2.1. ADN pur = 1,8 < A260/A280 < 2,1

4.3.1.3. Pureté de l'ADN (autres solvants)

4.3.1.3.1. ADN pur = 2 < A260/A230 > 2,2

4.3.2. Analyse par électrophorèse

4.3.2.1. Séparation par courant électrique selon la taille

4.3.2.2. L'ADN migre de la catode (-) vers l'anode (+)

4.3.2.3. Smear (traces)

4.3.2.3.1. Bandes larges : ADN non dégradé

4.3.2.3.2. Plus l'ADN est dégradé, plus le smear est éloigné du point de dépôt

4.3.3. Critère de qualité/quantité

4.4. Analyse ciblée

4.4.1. Besoin de connaître les gènes / la séquence au préalable

5. Séquençage haut-débit (NGS) : méthode ILLUMINA

5.1. Objectifs

5.1.1. Séquencer un génome entier

5.1.2. Faire le barcoding (espèce d'un individu)

5.1.3. Faire le metabarcoding (composition en espèces d'un échantillon)

5.2. Etapes :

5.2.1. 1) Préparation de la librairie

5.2.1.1. découpage de l'ADN en petits fragments

5.2.1.2. ajout d'adaptateurs aux fragments

5.2.2. 2) Fabrication du cluster

5.2.2.1. Les fragments avec les adaptateurs sont chargés sur la puce.

5.2.2.2. Les compléments des adaptateurs sont attachés sur la puce. Les fragments s'y hybrident.

5.2.2.3. Chaque fragment est amplifié plusieurs fois par PCR.

5.2.2.4. Les adaptateurs servent d'amorces. L'ensemble forme des clusters

5.2.3. 3) Séquençage

5.2.3.1. Nucléotides marqués avec un fluorochrome

5.2.3.2. Incorporés un à un

5.2.3.3. Détection de la fluorescence

5.2.4. 4) Analyse des données

5.2.4.1. Fragments remis dans l'ordre (avec génome de référence par exemple)

5.3. Analyse globale (non ciblée)

5.4. Applications

5.4.1. Metabarcoding

5.4.1.1. 1) Extraction d'ADN

5.4.1.2. 2) Préparation des banques d'ADN par PCR : amplification du gène barcode 16S ou 18S

5.4.1.3. 3) Séquençage